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酶標(biāo)儀的技術(shù)原理與操作指南

發(fā)布時間: 2025-06-16  點擊次數(shù): 40次

  一、技術(shù)原理

  酶標(biāo)儀,即酶聯(lián)免疫檢測儀,是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的專用儀器。它基于光電比色法或熒光檢測法,通過測量樣本對特定波長光的吸收程度或熒光信號強(qiáng)度,實現(xiàn)對生物樣本中待測物的定性和定量分析。

  (一)光電比色法原理

  酶標(biāo)儀的光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器變成一束單色光,進(jìn)入塑料微孔板中的待測標(biāo)本。單色光一部分被標(biāo)本吸收,另一部分則透過標(biāo)本照射到光電檢測器上。光電檢測器將這些光信號轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號,經(jīng)過一系列信號處理后送入微處理器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計算,最后由顯示器和打印機(jī)顯示結(jié)果。特定波長下,同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系,檢測單位用OD值(光密度)表示,OD值與光強(qiáng)度之間的關(guān)系遵循Bouger-amberT-beer法則。

  (二)熒光檢測法原理

  在熒光檢測中,酶標(biāo)儀通過特定波長的激發(fā)光照射樣本,使樣本中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。光電檢測器接收熒光信號并將其轉(zhuǎn)換為電信號,經(jīng)過處理后得到熒光強(qiáng)度值,該值與樣本中熒光物質(zhì)的濃度成正比。

  (三)波長選擇與雙波長檢測

  在測定檢測物時,選擇特定的波長進(jìn)行檢測,稱為測量波長。但每一種物質(zhì)對光能量還存在一定的非特異性吸收,為了消除這種非特異性吸收,再選取一個參照波長。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。例如,450nm和492nm兩個波長是目前ELISA測定最-常用的,考慮到雙波長比色的需要,還應(yīng)有630nm和405nm波長的濾光片。

酶標(biāo)儀-ST-MB96L主圖1_01.jpg


  二、操作指南

  (一)準(zhǔn)備工作

  儀器放置:將酶標(biāo)儀、配套的電腦及主機(jī)等放在平穩(wěn)、干燥的地方。

  電源連接與預(yù)熱:將酶標(biāo)儀與電腦連機(jī),依次打開電腦和酶標(biāo)儀的開關(guān),等待自檢,預(yù)熱5 - 30分鐘(不同型號儀器預(yù)熱時間可能不同),使儀器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。在預(yù)熱過程中,可根據(jù)具體情況設(shè)置所需要的波長和光線強(qiáng)度。

  軟件啟動與程序設(shè)置:打開與儀器配套的軟件,建立新的檢測程序或打開已有程序。創(chuàng)建新程序時,選擇所需創(chuàng)建的程序協(xié)議,如吸光值、化學(xué)發(fā)光、熒光強(qiáng)度等;選定試驗協(xié)議后,進(jìn)行波長選定、酶標(biāo)板選定,并設(shè)置protocol參數(shù),如酶標(biāo)板震蕩混勻樣品的時間、測量樣品結(jié)果的時間、樣品波長掃描范圍以及樣品環(huán)境溫度等。修改已有程序時,在酶標(biāo)儀打開界面中選定一個protocol,然后雙擊進(jìn)入程序設(shè)置界面進(jìn)行相應(yīng)修改。

  (二)樣品準(zhǔn)備

  樣品制備與稀釋:根據(jù)實驗要求,準(zhǔn)備好待檢測的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,并進(jìn)行相應(yīng)的稀釋和加樣。同時,應(yīng)控制好稀釋倍數(shù),避免樣品濃度過高或過低的影響。

  微孔板布置:在酶標(biāo)板中按照實驗設(shè)計布置待測和標(biāo)準(zhǔn)樣品,每個孔位加入適量的稀釋后的樣品。同時,在同一板中添加對照組和空白對照。

  (三)試劑添加

  根據(jù)實驗需求加入輔助試劑,如底物和酶標(biāo)記等。加入試劑時需要嚴(yán)格按照實驗流程進(jìn)行,按照正確的順序和比例加入試劑,避免污染和誤差。

  (四)混勻和孵育

  輕輕搖晃或輕輕拍打酶標(biāo)儀板,確保樣品和試劑充分混合。將酶標(biāo)儀板放置在恒溫條件下的孵化箱中進(jìn)行相應(yīng)的孵育時間,以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。

  (五)反應(yīng)停止和讀數(shù)

  反應(yīng)停止:在孵育結(jié)束后,根據(jù)試劑盒說明書中的指導(dǎo),加入適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)停止劑,終止反應(yīng)。

  讀數(shù)操作:將酶標(biāo)儀板放置在酶標(biāo)儀中,根據(jù)所測定的具體物質(zhì)選擇相應(yīng)的波長或濾光片,讀取吸光度或熒光強(qiáng)度值。

  (六)數(shù)據(jù)處理

  根據(jù)實驗需要,使用軟件或計算公式將讀數(shù)結(jié)果轉(zhuǎn)化為所需的具體物質(zhì)的濃度或活性。點擊電腦軟件上的“編輯"欄中的“復(fù)制到Excel",導(dǎo)出數(shù)據(jù)后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

  (七)儀器清理與維護(hù)

  取出酶標(biāo)板:數(shù)據(jù)處理完成后,打開儀器蓋,取出酶標(biāo)板。

  儀器清潔:蓋好儀器蓋,關(guān)閉酶標(biāo)儀電源,并將儀器擦拭干凈。

  定期維護(hù):按照設(shè)備的維護(hù)手冊,定期進(jìn)行維護(hù)和檢修工作,包括校準(zhǔn)和更換部件等。定期檢查儀器狀態(tài),如光源是否正常、濾光片是否清潔等;儀器出現(xiàn)故障時,應(yīng)及時聯(lián)系專業(yè)工程師進(jìn)行維修,避免盲目自行設(shè)置。


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